答：在基质胶孵育时倒扣细胞可以较好地避免细胞贴壁，同时若胶比较稀时细胞会因重力缘故沉底。倒扣培养板可使细胞不沉底避免细胞贴壁导致的无法形成良好的类器官结构。翻转过程不可用力过猛，以免基质胶受力贴壁。

答：EGF：表皮生长因子（Epidermal growth factor，EGF）是最早发现的生长因子，对调节细胞生长、增殖和分化起着重要作用。EGF可提高细胞内DNA拓扑异构酶活性，也可促进一些与增殖有关的基因表达，如myc、fos等 R-spondin-1：：R-spondin(Rspo) 是近年来新发现的蛋白家族，包括4个成员 (Rspo1~4)。已报道Rspo蛋白家族所有成员均为分泌性蛋白，均有两个富含半胱氨酸的furin-like结构域、1个TSP1结构域和富含碱性氨基酸的C端区域。Rspos通过激活并协同Wnt/β-catenin信号通路参与对细胞增殖和分化的调控，影响骨骼、肌肉、血管等组织的发育以及肢体和性腺的形成，并在多种疾病的发生过程中起重要作用。 FGF:成纤维细胞生长因子（Fibroblast Growth Factors，FGFs）它们调节多种细胞的迁移、增殖、分化、存活、代谢活动和神经功能。 Wnt3a：Wnt3a是Wnt信号通路的重要组成之一，属于依赖β-连环蛋白（β-catenin）的经典Wnt信号通路，Wnt信号通路在胚胎发育，细胞生长、分化，以及肿瘤发生中起到关键作用。 Noggin：蛋白质Noggin是在发育中起关键作用的骨形态遗传蛋白（BMP）的一种由体内分泌出的抑制剂。 VEGF：血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），又称血管通透因子（vascular permeability factor，VPF）是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。

答：我们知道类器官是一种在体外利用成体干细胞培养出的三维细胞培养物，与人体器官具有相似的组织学特征，并且能部分重现器官的生理功能。而在类器官重现目标器官组织学特性与生理功能前，必不可少的就是对类器官分化的诱导。 在进行类器官培养前，我们需要知道该器官的发育过程以及其发育相关的信号通路。并通过添加细胞因子的方式对相应的信号通路进行激活或抑制，以达到该器官在体内的信号通路效果。因此在类器官培养中因子使用、信号通路激活/抑制的正确与否，是能否重现器官组织学特性和生理功能的关键。例如心脏类器官中的WNT和BMP通路，脑类器官醋酸视黄醇诱导眼睛类器官。

答：小鼠小肠隐窝腔内黑色部位是死亡的内皮细胞聚集形成的。这是因为类器官内部缺乏循环系统。因此类器官尺寸较大时靠近中心的细胞难以和外界进行氧气和营养成分的交换。类器官结构尺寸越大，死亡的细胞就越多。如果能将类器官与血管类器官相结合形成内部循环系统，就能以此培养出尺寸更大的类器官。这也是一个研究方向。

答：大部分类器官可以在体外连续传代10次，有些类器官可以连续传代20次，并且维持原有的生长速度。

答：类器官的传代通常是根据培养的时间判断。一般在7-14天时进行第一次传代，后续则每7-10天传代一次。

答：黑色小颗粒大概率是杂质或细胞碎片，去除时可先将类器官消化下来，用培养基进行反复清洗，达到稀释杂质的作用。

答：1、类器官分离类器官与基质胶时，使用类器官解离液。类器官在解离液中时间一般不可超过3分钟。在解离液中浸泡时间过长，将导致类器官生长情况差甚至直接收到破坏失去活性。根据经验，小块细胞的混合物，可以观察到由10-50个细胞组成的细胞团，消化就完成了。 2、重新进行基质胶3D包裹时，基质胶占比也应在70%以上。

答：传统培养时，二维细胞平铺于培养皿底部，分泌因子直接进入培养基中，难以形成细胞的旁分泌。细胞间作用力微弱。而培养基中的物质无差别作用于每个细胞。在一些药物测试时，药物进入培养基后常常会对细胞进行无差别的杀死。难以模拟实际体内药物作用过程。 类器官在基质胶包裹下，基质胶支撑着细胞生长，形成立体结构。在特定培养基诱导下向不同方向分化生长。外部养分进入培养基后，基质胶与类器官外围细胞会像体内情况一样具有屏障作用。营养物质渗透形成浓度梯度。细胞代谢产物、分泌因子，形成局部微环境。模拟体内环境。