NeruoPrime Cerebral inducer Kit

NeruoPrime series 全脑类器官诱导试剂盒

1、 产品描述

NeruoPrime series 全脑类器官诱导试剂盒是模基生物以神经外胚层自分化体系为研发基础的一款脑区不定向分化试剂盒，通过四种组分完成经典的脑类器官分化流程即:神经外胚层分化、神经上皮出芽及神经管形成、神经扩张、脑成熟。诱导过程需要植入EB球于低生子因子基质胶(货号:082703)，诱导38天以上的全脑类器官表达TUJ1、SOX2、Nestin、NeuN等基础神经表征、FOGX1、CTIP2等前脑、皮层表征,进入长期培养后≥80天可少量表达GFAP、TH等功能神经元及胶质细胞Maker。

2、 产品信息

3、 其他自备材料和试剂

4、 模基生物推荐用细胞系

H1、H9、HN4、iPSCs帕金森患者来源DY043、iPSC-EGFP等

5、 新手须知

NeruoPrime series 脑类器官诱导试剂盒理论上可以形成至少98个脑类器官，但是建议每次诱导以1/2个六孔板启动分化流程，形成至少98个均一大小EB球进行全脑诱导流程。

注意事项：在使用时应始终穿戴防护服，在处理诸如人体细胞或其他生物及有害物质时应遵循安全的实验室规程。

仅用于科学研究。

6、 使用说明

a)     实验用品

低生长因子基质胶、StemGrowth series 多能干细胞金牌培养基、StemGrowth series EBs形成培养基、全脑类器官诱导试剂盒、超低黏附96孔u底板/超低黏附6孔培养皿

b)      使用程序：

b.1、PSC细胞培养及神经上皮干细胞NESC的二维诱导

1、   根据不同PSC细胞系的特性从ESC＜60P、iPSC＜50P中复苏一支细胞、经过两次高质量传代记作复苏后P3（干细胞培养操作见StemGrowth series多能干细胞金牌培养基 /StemGrowth UniMediX GoldenHold Medium培养SOP）

2、   PSC传代后细胞克隆密度达到80%, 10x显微镜下观测克隆边缘圆润光滑、干性维持良好即可进行EBs诱导，诱导克隆汇合时间计4-7天。

3、   对于3孔/6孔版 80 % 密度的PSC，准备12mL的StemGrowth serie EBs形成培养基补充12μL的StemGrowth serie抗胁迫补充剂。准备3mL StemGrowth serie水解酶温和消化液添加3μL StemGrowth serie 抗胁迫补充剂、准备50mL DPBS无菌不含钙镁，和10mL DMEM/F12预热到室温。

4、   使用不含钙镁的室温 DPBS洗涤六孔板的三个孔一遍，弃掉DPBS，每孔加入1mL的StemGrowth serie水解酶温和消化液37度消化7-10min。

5、   镜下观察细胞的消化情况、直到细胞边缘变的透亮且连片飘起即可终止消化，每孔加入1mL的DMEM/F12中合消化液，吹打至细胞完全脱落且成单细胞型态，进行台盼蓝计数细胞活力高于90%即可进行下一步诱导。

6、   130g/ 3min离心收集到的6mL细胞悬浮液，弃掉上清加入12mL的StemGrowth series EBs形成培养基1x StemGrowth series 抗胁迫补充剂,再次检测细胞活力和细胞计数，最终每mL的细胞量在50000-80000之间最佳。

7、   准备一个超低黏附的96孔u底板，将12mL的细胞悬液（含1x StemGrowth series 抗胁迫补充剂)加入加样槽中，使用排枪/移液枪每孔加入100μL的细胞悬液。加样完成后将培养皿用封口膜封好使用水平板式离心机1200rpm/3min离心。

8、   撕掉封口膜放入细胞培养箱培养过夜、第二天每孔加入100μL StemGrowth series EBs形成培养基不含 StemGrowth series 抗胁迫补充剂。

9、   48小时后悬浮的细胞即可聚集成球，边缘光滑圆润的EBs状态最佳。

注意！PSC克隆出现问题、自分化及漂浮的情况应再启动复苏扩增一株，不可直接用于诱导

b.2、神经外胚层诱导

1、   将诱导48小时的EBs转移到超低黏附6孔板里，每孔加入10个EBs后使用DPBS洗涤一次清除上个阶段的培养基残留，吸弃DPBS后每孔加入2mL的神经外胚层诱导培养基，每天2天换液一次，诱导共4天。

2、   出现神经外胚层扩张的EB边缘变的透亮，直径＞400μm，内部致密无空腔，整体呈现类似小鼠原代神经球的型态。

b.3、神经出芽

1、   当EBs直径达到相关标准时400-600μm即可进行基质胶包埋，4度化冻分装的低生长因子基质胶（082703）2mL。

2、   准备一张长宽均10cm的封口膜，在200μL枪头盒上按压出凹点，放置于10cm皿，使用酒精浸泡30秒后置于安全柜紫外烘干30min以上即可使用。

3、   使用宽口10-100μL移液枪头(量程50μL)吸取神经外胚层分化结束的EB与按压的凹点上，一次建议操作10个为佳。之后使用移液枪小心的吸弃凹点内的培养基残留后，每个凹点及EBs加入30μL的低生长因子胶小心包埋EBs，如若EBs在胶体边缘则使用10μL小枪头轻轻挑弄EBs周围的胶体让其置于中央部位。(注意不要形成气泡)

4、   将包埋好的EBs盖好，放于37度凝胶15min后使用无菌的镊子夹起封口膜，用1mL的神经出芽培养基将每排的EBs胶体贴着凹点的底部吹到超低黏附六孔板中，每孔最多放置10个类器官，每孔培养基体积不能大于3mL。

5、   如若一次性制作太多EBs，也可以直接将预冷30min以上的12mL的神经出芽培养基补充10%的低生长因子基质胶（货号：082703)，即1.2mL的胶体，漩涡混匀后。吸弃原孔板中的神经外胚层诱导培养基，每孔补充3mL神经出芽培养基+基质胶，诱导48小时后吸弃培养基，使用DPBS洗涤两次，再次加入3mL每孔不含基质胶的神经出芽培养基进行第6步操作。

6、   将超低六孔板放置于水平摇床(80rpm/s)里37度培养18天完成神经上皮的扩张，每两天换液一次。EBs一般在神经上皮扩张第4天的时候出现早期VZ、SVZ样的结构、12天后芽点慢慢汇合变黑。

b.4、神经及脑成熟

当EBs中心致密、外层形成疏松的上皮结构且直径大于1mm说明神经扩张到成熟阶段，完全弃去神经出芽培养基，每孔加入3mL的神经成熟培养基持续培养至38天后(每两天换液一次/80rpm/s)，EBs的直径大于2mm时内部会出现营养无法渗入的情况，需要使用1mL注射器将EBs周围的胶体小心的去掉后每孔加入3mL脑成熟长期培养基(每天换液)，并提高摇床转速至120rpm/s改善营养循环状态，让脑类器官可以长期培养＞100天。

V1.1版

更新时间：2025/06/23