StemGrowth UniMediX GoldenHold Medium

StemGrowth series多能干细胞金牌培养基

1、 产品描述

StemGrowth UniMediX GoldenHold Medium为新一代无饲养层、化学成分明确的多能干细胞（PSC）专用培养基，基于国际标准mTeSR体系优化开发，适用于人胚胎干细胞（hESC）及诱导多能干细胞（hiPSC）的长期未分化增殖培养。本体系补充氨基酸结构修饰的bFGF/FGF-G3、pro-TGF-β1和LR3IGF等高活性因子，通过精准调控细胞内外信号通路，维持PSC的自我更新与多能性正常表达。

2、 产品信息

4、 模基生物推荐用细胞系

H1、H9、HN4、iPSCs帕金森患者来源DY043、iPSC-EGFP等

5、 新手须知

StemGrowth UniMediX GoldenHold Medium 可和mTeSR及mTeSR plus、E8等体系快速转化，对于先前培养于上述体系的细胞建议使用原体系复苏至密度80%后进行传代，传代P2的第一天培养基已原培养体系Medium:StemGrowth 1:1并补充1x StemGrowth series 抗胁迫补充剂，第二天完全转化为StemGrowth不含StemGrowth series 抗胁迫补充剂，继续培养至P3即可适应StenGrowth体系的日常培养、维护、扩增、冻存。

具体步骤如下:

a)     阶段一：细胞复苏与传代准备

复苏与预培养：采用原培养体系（如mTeSR/mTeSR Plus/E8）复苏细胞，待细胞密度达80%时进行首次传代（P1）。

基质包被：使用干细胞金牌基质胶预处理培养皿，优化细胞贴附效率。

b)     阶段二：培养基梯度转换（P2代）

首日过渡：传代后第1天，培养基按 原体系 : StemGrowth = 1:1 混合，并添加 1×StemGrowth series 抗胁迫补充剂（含多胺含抗坏血酸含Rho-i），维持细胞存活与克隆完整性。

次日完全转化：第2天更换为 100% StemGrowth培养基（不含StemGrowth series 抗胁迫补充剂），持续培养至细胞密度达80-90%。

c)     阶段三：完全适应与扩增（P3代及后续）

采用纯StemGrowth培养基进行常规传代、扩增及冻存，每日换液（2 mL/孔，6孔板），建议传代周期为3-4天。

注意事项：在使用时应始终穿戴防护服，在处理诸如人体细胞或其他生物及有害物质时应遵循安全的实验室规程。

仅用于科学研究。

6、 使用说明

a)     基质胶铺板（以干细胞金牌基质胶-0827775包被6孔板为例）

a.1、分装 基质胶

1. 货号0827775的基质胶，操作说明中不标注蛋白浓度，而是以Dilution Factor表示，如某批次的推荐Dilution Factor为400 μL，则表明400 μL可包被4块6孔板，分装数量=5 mL /400=12。

2. 准备12个无菌1.5 mL EP管，标记基质胶日期、操作人；1mL无菌吸头；EP管架，均置于-20℃冰箱中预冷1小时。

3. 将基质胶埋于碎冰中放置4℃冰箱过夜解冻，当基质胶完全解冻即可开始分装。

注：在解冻时，将基质胶放置冰箱内侧角落，切勿放在靠近冰箱门附近。准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的基质胶、预冷的1.5 mL EP管及EP管架、1mL吸头放置于生物安全柜上。 混匀基质胶，无菌分装于各个1.5 mL EP管中，并置于冰上。当吸头被堵塞可能导致分装体积不准时需要更换吸头。

6. 将分装后的基质胶 置于-20℃冰箱中保存。

a.2、铺板

1. 取36 mL冷藏DMEM/F12或者Rhoi Free铺板液于50 mL离心管中，准备4个6孔板于-20度预冷过夜，标记基质胶、批号、日期和操作人。

2. 1 mL无菌吸头置于-20℃冰箱中预冷1小时，取出一支冷冻的基质胶（400 μL）置于4℃冰箱解冻至完全化冻。

3. 准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的基质胶、预冷的1 mL吸头放置于生物安全柜上。

4. 用预冷吸头将解冻过的基质胶（400 μL）加入冷的DMEM/F12并反复吹打解冻混匀。

5. 吸出已解冻混匀的基质胶加入离心管中剩余的DMEM/F12，使用10 mL移液管再次反复吹打混匀。

6. 分装1.5 mL/孔于4个六孔板中，轻轻摇晃混匀。

7. 培养板置于37°凝胶1小时后即可使用，或置于4℃冷藏过夜，两周内使用。

b)     复苏hESC/iPSC（以复苏一株细胞为例）

b.1、基质胶铺板

1.      将基质胶埋于碎冰中放置4℃冰箱过夜解冻，放置冰箱内侧角落；

2.      第二天观察流动性，全部溶解后，冰盒上分装，每管400μL，分装后的基质胶置于-20℃冰箱保存；

3.      取3mL冷藏DMEM/F12于15mL离心管中，用预冷吸头将33.33μL基质胶加入DMEM/F12中，并反复吹打10-20次（参考稀释比例如下：DMEM/F12:基质胶=9mL:100μL）；

4.      分装1.5mL/孔于一个六孔板中，八字或水平摇晃混匀，置于4℃冷藏过夜。（如若两周内使用，需要贴封口膜）

注意事项：分装前，用移液枪轻柔吹打基质胶20-30次，避免产生气泡。所有分装所需耗材（六孔板，1.5mL EP管，1mL无菌吸头）需提前1h置于-20℃冰箱预冷。

b.2、复苏hESC/iPSC（一株细胞为例，复苏2孔）

1.      将水浴锅预热至39℃，并将基质胶包被的6孔板提前1小时置于37℃培养箱中；

2.      取10mL StemGrowth多能干细胞金牌培养基，按照1.：1000比例加入10μL的1xStemGrowth series抗胁迫补充剂，恢复至室温；

3.      取出一支冷冻的细胞置于39℃水浴锅手持轻轻摇晃，2min内解冻，肉眼观察细胞悬液内冰晶即将完全消失时取出；

4.      75%酒精无尘纸擦拭冻存管表面，转入生物安全柜；将细胞悬液移至事先准备好的含10mL DMEM/F12的离心管中（注意：需将枪头贴壁并置于培养基液面上方缓慢滴入）；

5.      150g离心5min或200g离心3分钟；

6.      弃去上清，贴壁加入10mL StemGrowth多能干细胞金牌培养基（含0.1%抗胁迫补充剂），轻轻吹打2次；

7.      取出37℃培养箱中的六孔板，贴壁吸除两个孔中的DMEM/F12；

8.      将细胞悬液按5mL/孔加入六孔板中的两个孔，水平十字摇匀三次后置于37℃培养箱中培养；

9.      换液：18-24小时后吸除培养基，用无菌PBS贴壁轻洗细胞一次后弃去PBS，加入2mL多能干细胞金牌培养基（不含抗胁迫补充剂），之后每天换液。

b.3、细胞培养与传代维持（复苏后传代流程）

注意：针对刚复苏的细胞，推荐按照下述传代三次流程恢复细胞状态！

每日换液并观察细胞状态，复苏培养约3-4天后，直至细胞克隆密度达到80%以上进行首次传代。

l   首次传代采用低密度方案

1.      使用DPBS贴壁清洗细胞2次，每孔加入1.5mL StemGrowth serier消化液，置于37℃培养箱解离7min；

2.      去除消化液后，用DPBS贴壁清洗细胞1次，每孔加入1mL多能干细胞培养基（含0.1%抗胁迫补充剂），轻柔吹打3次以重悬细胞；

3.      收集2个孔中的细胞悬液（共2mL）至15mL离心管中，轻柔吹打5次以进一步解离为更小团块；

4.      取200μL细胞悬液（剩余1.8mL悬液丢弃）置于含12mL多能干细胞金牌培养基（含0.1%抗胁迫补充剂）的15mL离心管中，轻柔吹打混匀3次后，接种至已包被并预热的六孔板中（每孔2mL）;

5.      过夜培养后，更换为不含抗胁迫剂的培养基，此后每日换液，直至细胞密度达到80%。

l   第二次传代采用高密度方案

1.      使用DPBS贴壁清洗细胞2次，每孔加入1.5mL StemGrowth serier消化液，置于37℃培养箱解离7min；

2.      去除消化液后，用DPBS贴壁清洗细胞1次，每孔加入1mL多能干细胞培养基（含0.1%抗胁迫补充剂），轻柔吹打3次以重悬细胞；

3.      收集6个孔中的细胞悬液（共6mL）至15mL离心管中，轻柔吹打5次以进一步解离为更小团块；

4.      取1mL细胞悬液（剩余5mL悬液丢弃）置于含24mL多能干细胞金牌培养基（含0.1%抗胁迫补充剂）的50mL离心管中，轻柔吹打混匀5次后，接种至已包被并预热的两个六孔板中（每孔2mL）;

5.      12小时后更换为不含抗胁迫剂的培养基，继续培养3天。无论此时细胞密度如何，均需进行第三次传代。

l   第三次传代采用超低密度方案

1.      取1孔使用DPBS贴壁清洗细胞2次，加入1.5mL StemGrowth serier消化液，置于37℃培养箱解离7min；

2.      去除消化液后，用DPBS贴壁清洗细胞1次，加入1mL多能干细胞培养基（含0.1%抗胁迫补充剂），轻柔吹打3次以重悬细胞；

3.      取100μL细胞悬液置于含12mL多能干细胞金牌培养基（含0.1%抗胁迫补充剂）的15mL离心管中，轻柔吹打混匀3次后，接种至已包被并预热的六孔板中（每孔2mL）；

4.      12小时后更换为不含抗胁迫剂的培养基，每日换液，直至细胞克隆密度达到80%

注：在hPSC培养过程中，如果细胞的汇合度超过50%，建议更换培养基时，培养基的体积增加至3-4mL/孔。

经过上述传代三次方案，可恢复细胞状态，后续培养传代可参考下述常规传代方案。

c)      传代hESC/iPSC（以6孔板为例）

1. 传代条件：① 细胞汇合度达85%左右，一般情况下每4-8天传代；② 细胞汇合度较低，生长密度分布不均匀。

注：即使克隆团较小、汇合度不足，也建议不要连续培养超过10天。

2.传代比例：可根据细胞生长状态和实验需要按1:5~1:12的比例进行传代，如果细胞正常，克隆团汇合度85%，大小均匀，建议按照1:12进行传代，如果密度偏低，则可降低传代比例；密度偏高，则增加传代比例。

注：1:12传代就是1个孔传12个孔（以6孔板为例）。

3. 将基质胶包被的6孔板，提前放置培养箱中约1小时（37℃）。

4. 根据传代接种的孔数准备2 mL/孔的StemGrowth多能干细胞金牌培养基，并按1：1000比例加入StemGrowth series 抗胁迫补充剂，恢复至室温（25℃）。

5. 将孔内培养基吸取，加入2 mL/孔的DPBS（不含钙镁），轻轻摇晃清洗后吸弃。

6. 加入1.5 mL/孔的StemGrowth series 消化液完全覆盖孔底。

7. 置于37℃培养箱中孵育5-7 min。

注：① 消化5 min后镜下观察细胞变化，当大部分细胞变亮变圆，且细胞尚未脱离基质或漂起时即可终止消化，若大部分细胞仍未变亮，则需要延长消化时间；② 保持6孔板与培养箱金属隔板直接接触，使6孔板受热均匀，不要叠放。

8.消化结束后轻轻地将细胞培养板拿回生物安全柜，避免震荡摇晃细胞，倾斜并吸除消化液。

9.及时加入1-2mL/孔预温的StemGrowth多能干细胞金牌培养基（含0.1%抗胁迫补充剂），轻柔吹打小于3下使下细胞脱落。有部分细胞（10%～15%）未脱离基质是正常现象。

10. 吸取6孔板中的基质胶溶液，加入预温的StemGrowth多能干细胞金牌培养基（含0.1%抗胁迫补充剂）2 mL/孔。

11. 在6孔板上标记细胞名称、代次、传代比例、日期、操作人。将步骤9获得的细胞悬液轻轻摇匀，按预先设定的传代比例均匀分配于孔板中。

注：为了铺板均匀并降低对细胞的损伤，可以将步骤9获得的细胞悬液收集至2mL离心管，轻柔颠倒混匀细胞1-2次；再按照传代比例接种。

12. 接种后，水平十字摇匀6孔板三次，置于37℃，5% CO2浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀6孔板三次，培养过夜。

13. 18-24小时后更换新StemGrowth多能干细胞金牌培养基，此后每天换液，4-8天后继续传代/冻存。

表1：hESC/iPSC传代&培养操作试剂推荐用量

b)     冻存hESC/iPSC（6孔板每孔可冻存1管）

1. 当细胞汇合度达85%左右可收获冻存，一般6孔板每孔可冻存1管。

2. 准备相应数量的1.5/2 mL冻存管，标记细胞名称、代次（P#）、日期、操作人。

3. 取出4℃冰箱中的StemFreez干细胞冻存液 ，置于室温预温，使用前注意摇匀。

4. 吸取上清液，使用DPBS贴壁轻洗细胞2次，每孔加入1.5mL StemGrowth serier消化液，置于37℃培养箱解离7min；

5. 去除消化液后，用DPBS贴壁轻洗细胞1次，每孔加入1mL37℃预热的干细胞冻存液，轻柔吹打3次，水平十字摇匀3次；

6. 吸取500μL细胞悬液加入冻存管中，置于梯度冻存盒中转移至-80℃冰箱，2天后转移至液氮储存。

V2.4版

更新时间：2026/03/30