模基生物小鼠小肠类器官试剂盒

产品描述

模基生物小鼠小肠类器官培养试剂盒是一款用于建立和维持小鼠肠道成体干细胞来源的小肠类器官培养基套装，该试剂盒提供了完整的从小肠隐窝分离、隐窝回收、隐窝活性分析及培养的全套试剂。可较大程度维持小肠隐窝的活性，并提升小肠类器官的形成率，所培养的小鼠小肠类器官主要由小肠干细胞、快速扩增细胞、肠吸收细胞、潘氏细胞、杯状细胞和少量肠内分泌细胞组成，在自我更新能力、组织结构、细胞类型和功能方面，小鼠小肠类器官能部分重现小鼠肠上皮的特征，因此是肠道稳态和疾病机制研究的理想体外模型。

产品信息

其他自备材料和试剂

小鼠小肠类器官的建立与传代培养

Ø 原代小鼠小肠类器官的建立

1.取样：小鼠断颈处死，表面喷洒酒精杀菌。在无菌条件下取出近胃端3~10 cm小肠组织，用镊子去除肠道外部的肠系膜、脂肪，放入4℃预冷的含双抗的DPBS溶液中。

2.清洗：使用手术剪将肠管剪开，肠腔面朝上，一只手使用手术镊夹住肠组织一端，另一只手使用手术刀片轻轻刮去肠腔表面肠绒毛，待肠绒毛被刮净后，将肠组织置于新的含DPBS 的培养皿中清洗，重复清洗 2 次。 将清洗后的小肠组织剪碎至 2 mm 宽，转移至新的培养皿中，用 DPBS 清洗 2 遍。

3.消化：将清洗好的肠段转移至含有5mmol/L EDTA 的预冷 DPBS 中消化，置于 4℃或碎冰中孵育20~30min，消化 20 min左右可用移液器轻柔吹打肠段，取上清显微镜下观察，待上清出现完整隐窝即可终止消化，若无隐窝可适当延长消化时间。

4.清洗：消化完成后，将组织碎片转移到新的含 DPBS 的培养皿中清洗，重复 2 次以去除EDTA。

5.重悬：用 5mL 移液管在预冷的 0.1%BSA 的 DPBS 的培养皿或 50mL 离心管中吹打、重悬组织碎片，使组织反复穿过移液管尖以产生机械剪切力从而使隐窝与基底层分离，取一部分悬液镜检，当可以看到大量的隐窝样结构后，停止吹打，并对吹打后的组织悬液进行 70μm 滤网过滤。

6.收集：收集穿过滤网的组织悬液，300g 离心力 4℃离心 3min。

7.计数：弃上清，使用 1mL0.1%BSA 的 DPBS 重悬组织沉淀，取 20μL 悬液进行镜检和隐窝计数，计数完成后吸取包含所需隐窝量的悬液，300g 离心力 4℃离心 3min，弃上清后置于冰上。。

8. 用适量的基质胶 重悬组织沉淀，推荐重悬密度为每 10μL基质胶悬液包含 70 至 100 个隐窝，重悬后置于冰上，重悬时间不超过 30s 以避免基质胶过早凝固。

注意：基质胶稀释比例应在70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。

9. 将基质胶 和组织细胞的混合悬液点入 24 孔板底部正中央，每孔 30μL 左右，避免悬液接触孔板侧壁。。 

10.将接种完成后的培养板至于37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育30 min左右待基质胶凝固。

11.待基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入已配制好的小鼠小肠类器官完全培养基，24孔板每孔500μL，避免破坏已凝固结构。

12.将24孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养。

13.每2~3天更换一次培养基，更换培养基时应避免破坏基质胶。密切监测类器官生长状态，理想情况下，小鼠小肠类器官应在5至7天内建成。