Human Intestine Organoid Medium Kit Plus

人小肠类器官培养基套装Plus

1、 产品描述

模基生物人小肠类器官培养试剂盒（Human Intestine Organoid Medium Kit）是一款用于建立和维持人肠道成体干细胞来源的小肠类器官培养基套装，该试剂盒提供了完整的从小肠隐窝分离、隐窝回收、隐窝活性分析及培养的全套试剂。可较大程度维持小肠隐窝的活性，并提升小肠类器官的形成率，所培养的人小肠类器官主要由小肠干细胞、快速扩增细胞、肠吸收细胞、潘氏细胞、杯状细胞和少量肠内分泌细胞组成，在自我更新能力、组织结构、细胞类型和功能方面，人小肠类器官能部分重现人肠上皮的特征，因此是肠道稳态和疾病机制研究的理想体外模型。

2、 产品信息

3、 其他自备材料和试剂

4、 人小肠类器官完全培养基的制备

1、 培养基解冻：收到类器官培养基后，将培养基置于4℃冰箱解冻。

2、 培养基分装：待培养基完全解冻后上下颠倒充分混匀，在生物安全柜或洁净工作台中根据日常需求量分装，推荐类器官培养基分装成10mL/管，培养因子B分装为40μL/管；

3、 保存方法：分装后的培养基请密封后储存于-20℃，使用时取出分装的培养基放置室温平衡后即可使用。

4、 培养基配制：请按以下方式配制培养基：

a) 人小肠类器官扩增培养基配置：取10mL人小肠类器官基础培养基添加40μL人小肠类器官培养因子B(250×)。

b) 人小肠类器官分化培养基：人小肠类器官基础培养基无需添加培养因子，可直接作为人小肠类器官分化培养基使用。

5、 人小肠类器官的建立

注意：涉及原代人体组织材料的研究必须遵循所有相关的机构和政府法规。在收集原代人体组织材料之前，必须获得所有受试者的知情同意。

1、 取样：使用离心管将原代人小肠组织收集在预冷的活组织细胞保存液中，将组织样本保存在4℃，直到开始分离。

2、 清洗：将组织样本转移至装有预冷DPBS缓冲液的培养皿中，肠腔面朝上，一只手使用手术镊夹住肠组织一端，另一只手使用手术刀片轻轻刮去肠腔表面肠绒毛，待肠绒毛被刮净后，将肠组织置于新的含DPBS的培养皿中清洗，重复清洗2次。将清洗后的小肠组织剪碎至2mm宽，转移至新的培养皿中，用DPBS清洗2遍。

3、 消化：将清洗完成后的组织块转移至50mL离心管内，加入10mL正常组织消化液摇匀，置于37℃消化20-40min（视样本量而定，可在消化20min时吹打混匀后镜下观察消化情况，若观察到完整的隐窝结构即可进行下一步操作）。

4、 清洗：消化完成后，静置待肠段沉淀，弃上清。加入2倍体积的DPBS终止消化，轻柔摇匀，静置后弃上清，重复2次以去除消化液。

5、 重悬：用5mL移液管在预冷的0.1%BSA的DPBS的培养皿或50mL离心管中吹打、重悬组织碎片，使组织反复穿过移液管尖以产生机械剪切力从而使隐窝与基底层分离，取一部分悬液镜检，当可以看到大量的隐窝样结构后，停止吹打，并对吹打后的组织悬液进行70μm滤网过滤。

6、 收集：收集穿过滤网的组织悬液，300g离心力4℃离心3min。

7、 计数：弃上清，使用1mL 0.1%BSA的DPBS重悬组织沉淀，取20μL悬液进行镜检和隐窝计数，计数完成后吸取包含所需隐窝量的悬液，300g离心力4℃离心3min，弃上清后置于冰上。

8、 用适量的基质胶重悬组织沉淀，推荐重悬密度为每10μL基质胶悬液包含70至100个隐窝，重悬后置于冰上，重悬时间不超过30s以避免基质胶过早凝固。

注意：基质胶稀释比例应在70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。

9、 将基质胶和组织细胞的混合悬液点入24孔板底部正中央，每孔30μL左右，避免悬液接触孔板侧壁。将接种完成后的培养板置于37℃、5% CO₂恒温培养箱中，孵育30min左右待基质胶凝固。

10、 待基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入已配制好的人小肠类器官培养基，24孔板每孔500μL，避免破坏已凝固结构。

注：使用方法推荐从D0到D2使用人小肠扩增培养基（含B），D2时更换为人小肠类器官分化培养基（不含B）培养D2-D8。

11、 将24孔板置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。

12、 每2~3天更换一次人小肠类器官扩增培养基，操作时应避免破坏基质胶。密切监测类器官生长状态，理想情况下，人小肠类器官应在5至7天内建成。

6、 人小肠类器官分化培养

注意：人小肠类类器官分化培养前需要经过传代扩增培养2天后进行。

1、 待P1代人小肠类器官培养到直径为200~500μm大小时（或变黑不再增大时），即可进行人小肠类器官的传代（每代5天左右）。用经过润洗液润洗的枪头吹打刮取类器官，并将小肠类器官和培养基悬液转移至经过润洗液润洗的1.5mL EP管中。

2、 用经过润洗液润洗的枪头用力吹打重悬类器官悬浮液，多次吹打（5~10次）使小肠类器官与基质胶分离，300g离心3min。

3、 弃上清，加入1mL基础培养基再次吹打类器官5~10次，取少量悬液镜检观察类器官状态：

1) 若类器官已分散成碎片，则可选择机械吹打分散类器官后，直接300g离心3min，离心后用PBS或基础培养基清洗2次。

2) 若类器官比较完整可300g离心3min后，弃上清，加入5倍于基质胶和人小肠类器官混合物体积的类器官消化液，吹打混匀后置于37℃培养箱中消化2min。加入5倍于消化液体积的基础培养基终止消化。离心后用PBS或基础培养基清洗2次。

4、 用适量的基质胶重悬清洗后的类器官沉淀，重悬后置于冰上，重悬时间不超过30s以避免基质胶过早凝固。注意：基质胶稀释比例应在70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。

5、 将基质胶和细胞的混合悬液点入培养孔板底部正中央，使用枪头稍微摊平悬液，注意避免悬液接触孔板侧壁。（推荐：96孔板接种3~10μL/孔，48孔板接种10~20μL/孔，24孔板接种20~30μL/孔）。注意：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。。

6、 将培养板放入37℃和5% CO₂的培养箱中15~25min，让基质胶凝固。

7、 待基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入室温平衡的人小肠类器官扩增培养基，避免破坏已凝固结构。（推荐：96孔板加入100μL/孔，48孔板加入250μL/孔，24孔板加入500μL/孔）。

8、 将培养板置于37℃和5% CO₂的恒温培养箱中。培养2天后，小心地从孔中吸出培养基，并加入新鲜的室温平衡的人小肠类器官分化培养基，每天更换一次培养基。

V2.4版