模基生物人结肠类器官培养基套装(扩增)
产品描述
模基生物人结肠类器官培养基套装(扩增)是一款用于扩增人结肠类器官的完全培养基,扩增时的人结肠类器官主要由结肠干细胞和结肠祖细胞组成。结肠类器官在自我更新和分化能力、组织结构、细胞类型和功能方面,重现了体内结肠上皮的特征,因此是人结肠研究的理想体外模型。
产品信息
产品名称 |
产品货号 |
规格 |
储存/运输 |
保质期 |
人结肠类器官培养基套装(扩增)Plus |
MA-0817H001DLP |
500ml |
-20℃ |
24 个月 |
MA-0817H001DLP |
100ml |
其他自备材料和试剂
产品名称 |
产品货号 |
模基生物金牌基质胶 |
082701/082703/082755 |
上皮类器官基础培养基 |
MB-0818L07 |
类器官培养润洗液 |
MB-0818L03L/S |
模基生物基质胶分装预冷盒 |
AB-YL1005 |
Fetal Bovine Serum (FBS) |
- |
EDTA (0.5 M, pH 8.0) |
- |
DPBS (1X), 液体,不含钙和镁 |
- |
70 μm细胞滤网 |
- |
1.收到类器官培养基后,将培养基置于四度冰箱进行解冻;
2.将解冻后培养基上下颠倒充分混匀,在无菌的生物安全柜或超净工作台中将培养基进行分装,推荐分装成 10ml 规格;
3.将分装后的培养基储存于-20℃,使用时拿出分装后的培养基解冻后即可使用。
注意:
² 分装后的类器官培养基需储存于-20℃,有效期两年,注意避免反复冻融;
² 解冻后类器官完全培养基可在 4°C 储存,建议在两周内使用;
² 类器官培养基中内含有细菌及真菌抗生素。
人结肠类器官的建立与传代培养
注意:涉及原代人体组织材料的研究必须遵守所有相关的机构和政府法规。在收集主要人体组织材料之前,必须获得所有受试者的知情同意。
Ø 原代人结肠类器官的建立
1.取样:使用离心管将原代人结肠组织收集在冰冷的原代组织储存液中,将组织样本保存在 4°C,直到开始分
离。
2.清洗:将组织样本转移至装有预冷DPBS缓冲液的培养皿中,肠腔面朝上,一只手使用手术镊夹住肠组织一端,另一只手使用手术刀片轻轻刮去肠腔表面粘液或残留的粪便,接着将结肠组织置于新的含 DPBS 的培养皿中清洗2-3次。 将清洗后的肠组织剪碎至2-5 mm宽,随后转移至50ml离心管中,剧烈震荡30s (垂直上下震荡90 次一上一下算一次,约 1s 三次) 弃上清,重复3次。
3.消化:加入30 mL的DPBS 溶液中再加入150 μL 0.5M EDTA,至EDTA终浓度为2.5 mM。置4℃摇床上,80rpm,消化 60 min。
4.清洗:消化完成后,静置待肠段沉淀,弃上清。加入预冷DPBS,轻柔摇匀,静置后弃上清,重复2次以去除 EDTA。
5.重悬:加入30 mL预冷的含0.1%BSA的DPBS,涡旋30s,取上清70μm滤网过滤,收集穿过滤网的组织悬液,记为馏分1。重复收集2次,记为馏分2和馏分3。
6.收集:300g 离心力 4℃离心3min。
7.计数:弃上清,根据沉淀量分别使用0.1%BSA的DPBS重悬组织沉淀,取20μL 悬液进行镜检和隐窝计数,计数完成后吸取包含所需隐窝量的悬液,300g 离心力 4℃离心3min,弃上清后置于冰上。
8.用适量的基质胶重悬组织沉淀,推荐重悬密度为每10μL 基质胶悬液包含100至200个隐窝,重悬后置于冰上,重悬时间不超过30s以避免基质胶过早凝固。
注意:基质胶稀释比例应在70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。
9.将基质胶和组织细胞的混合悬液接种至24孔板底部正中央,每孔30 μL左右,避免悬液接触孔板侧壁。
注意:为防止基质胶室温凝固,此步骤应尽快完成。
10.将接种完成后的培养板至于37℃二氧化碳恒温培养箱中,孵育30 min左右待基质胶凝固。
11.待基质胶完全凝固后,沿壁缓慢加入已配制好的人结肠类器官完全培养基(扩增),24孔板每孔加入500μL,避免破坏已凝固结构。
12.将24孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养。
13.每2~3天更换一次培养基,更换培养基时应避免破坏基质胶。密切监测类器官生长状态,理想情况下,人结肠类器官应在5至7天内建成。
Ø 人结肠类器官的传代培养和分化
1. 用经过润洗液润洗的枪头吹打刮取类器官,并将结肠类器官和培养基悬液转移至经过润洗液润洗的 1.5 mL EP 管中。
2. 用经过润洗液润洗的枪头用力重悬类器官悬浮液,多次吹打使得类器官与基质胶分离。
3. 300×g,4℃离心 3 min,弃上清,用经过润洗液润洗的枪头加入 200 μL 类器官消化液并充分混匀,37℃条件下消化 1- 3 min,消化结束后加入 1 mL 上皮类器官基础培养基吹打混匀。
4. 300×g,4℃离心 3 min,弃上清,再次加入 1 mL 上皮类器官基础培养基并混匀。
5. 300×g,4℃再次离心 3min,弃上清后置于冰上。
6. 用适量的基质胶重悬类器官沉淀,重悬后置于冰上,重悬时间不超过 30 s 以避免基质胶过早凝固。
注意:基质胶稀释比例应在 70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。
7. 将基质胶和类器官的混合悬液点入 24 孔板底部正中央,避免悬液接触孔板侧壁,每孔 30 μL 左右。
注意:为防止基质胶室温凝固,此步骤应尽快完成。
8. 将接种完成后的培养板至于 37℃二氧化碳恒温培养箱中,孵育 30 min 左右待基质胶凝固后取出。
9. 配制人结肠类器官扩增培养基。
10. 待基质胶完全凝固后,沿孔壁加入提前预热的人结肠类器官扩增培养基,24孔板每孔 500μL。
11. 将 24孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养,待新长出的类器官直径超过 100 μm 后可进行分化实验。
12. 分化前需要吸去24孔板培养孔中的人结肠类器官(扩增)培养基,并加入500 μL 提前配制的人结肠类器官(分化)培养基,分化通常需要 4 d 以上时间,分化期间每隔 2 d 更换一次分化培养基,分化完成后可进行后续实验。